周围神经生物活性管桥的制备和应用研究

　　神经损伤后由于存在神经缺损、神经瘤及疤痕形成等原因，通过自发神经再生往往失败，需要外科干预来修复神经缺损。在人体短于1CM神经缺损可以直接缝合，更长的神经缺损往往需要自体神经移植来修复。自体神经移植目前被认为是修复周围神经缺损的“金标准”，但由于存在供区缺乏、供区后遗症、移植物疤痕化、塌陷、再生轴突弥散等问题，使自体神经移植在临床的应用受到限制。

　　为了克服自体神经移植的缺陷，曾尝试应用自体静脉、动脉、羊膜、人工合成材料以及异体材料替代自体神经，但是它们都没能在修复人体3CM以上周围神经缺损时取得满意效果，因而限制了它们的临床应用。组织工程技术的出现为周围神经损伤的修复提供了新的研究方向。

　　一、应用组织工程技术构建神经管桥

　　组织工程技术的出现标志着再生医学新时代的来临。19世纪以来，应用组织工程技术构建神经管桥桥接周围神经缺损的方法层出不穷，促进神经再生的效果也越来越满意。

　　1898年Forssman发现再生轴突总是朝向远侧神经断端生长而不向其他组织生长。他将这种远侧神经端对再生轴突的明显吸引作用称为神经趋化性。直到20世纪80年代，Lundborg等[5]通过Y型硅胶管实验证实周围神经再生确实存在神经趋化性，并且还具有组织特异性、神经束特异性和功能特异性。

　　所谓神经管桥就是用生物或非生物的材料预制成管状，再将神经的远近断端放入管内，断端间留出一定空隙（神经再生室），两断端神经外膜与管壁各缝合固定，随后神经近端轴突发芽，沿着管腔从近端长入远端。神经管桥可以防止纤维瘢痕组织的侵入，避免神经瘤的形成，并利用远端神经的趋化因子使轴突准确对合。同时，神经管桥中的生物微环境可以人为控制和改变，使之适宜于神经再生。

　　IoannisV.Yannas等[1]回顾性研究各种神经再生动物模型，认为管壁包含胶原和可生物降解的合成聚合物的神经管桥其促神经再生能力明显优于硅胶管，具备以下特征的神经管桥具有很强的神经再生能力：SCs悬液；可溶的酸性或硷性成纤维细胞生长因子；不溶的细胞外基质优于可容性的基质或凝胶；沿管桥轴向排列的多聚细丝；高渗的、不溶的具有特殊结构的细胞外基质类似物以及可以控制的降解速度。

　　构建具有生物活性的组织工程化神经管桥必须具备三要素：（1）具备三维空间结构的支架；（2）具有生物活性的种子细胞和（或）神经营养因子；（3）两者良好接合如添加细胞外基质。理想的周围神经组织工程支架材料必须具有：良好的生物相容性；良好的生物降解性；具有三维立体多孔结构；良好的可塑性和一定的机械强度；良好的材料-细胞界面。

　　依据制成材料不同，目前常用于制备神经管桥的支架材料有三大类：（1）生物型材料：主要包括静脉、动脉、骨骼肌、脐带血管等；（2）化学萃取的同种异体神经；（3）可降解的合成材料：主要包括几丁质（chintin）类，聚乳酸（PLA）类，PHEMA-MMA等。神经管桥内活性成分可分为三大类：（1）不溶性细胞外基质分子，包括层粘连蛋白（laminin）、纤维连接蛋白（fibronectin）和胶原蛋白（collagen）等；（2）可溶性神经营养趋化因子如神经生长因子（NGF），脑源性神经生长因子（BDNF），碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）睫状神经营养因子（CNTF）；（3）神经支持细胞如SCs，骨髓基质干细胞（BMSc）及神经片段。

　　下面对几种常用的生物活性神经管桥制备进展状况作一综述。

　　二、生物活性神经管桥的制备

　　1.PLA类神经管桥

　　聚乳酸（polylacticacid,PLA）、聚乙醇酸（polygiycolicacid,PGA）及聚羟基乙酸的共聚物〔poly2（D,L2lac2tide2co2glycolide）,PLGA〕是—类生物相容性良好的可降解材料。降解产物无毒及良好的生物相容性使它们成为目前公认的控释骨架，是目前国内外组织工程支架技术的研究热点，已被美国食品与药物管理局（FDA）批准广泛用作医用缝线、暂时性支架和药物控释载体。PLA、PGA及其共聚物在组织工程中应用的主要结构形式有纤维支架、多孔泡沫以及管状结构等。

　　Vacanti等首先将PGA、PLA用作软骨细胞体外培养基质材料，通过组织工程方法获得新生软骨成功。其后PLA、PGA及其共聚物被广泛应用于组织工程，目前以PLA类支架复合神经细胞及促神经生长的因子制备神经管桥以促进神经生长应用尤为广泛。研究认为多孔的PLA类生物性管桥不仅为神经再生提供结构支持，而且有为局部神经营养因子运输载体的功能，这些功能使PLA类生物性管桥具有良好的支持，促进，引导轴突再生的能力。

　　YangYang,LauraDeLaporte等[12]以PLA为中心体混合NACL采用气体发泡的方式获得多孔和单孔管桥。在发泡前NGF被混合或者压缩到中心体内，制备成具有缓释功能的神经管桥。其缓释时间至少持续42天，缓释的NGF仍保持生物活性。体内试验证明管桥仍保持其开始结构，且利于细胞迁移入管桥内。HannahStorrie等[13]将DNA质粒压缩入以微米或纳米级的PLA类支架，制备成可以在时间或空间上控制DNA释放的神经管桥，可以成功达到神经营养因子持续、局部释放的目的。

　　尽管目前PLA、PGA及其共聚物是应用最为广泛的组织工程细胞外基质材料，但在应用过程中也发现不少缺点，如亲水性差、细胞吸附力较弱、引起无菌性炎症机械强度不足、PLA、PGA及其共聚物中残留的有机溶剂的细胞毒作用和可能引起的纤维化以及与周围组织的免疫反应等。此外价格昂贵是限制其广泛应用的另一个重要原因。

　　2.PHEMA-MMA类神经管桥

　　PHEMA-MMA（poly2-hydroxyethylmethacrylate-co-methylmethacrylate）由于其良好的生物相容性在医学上广泛应用已经超过25年。人们通过改变PHEMA-MMA的机械成分将其制备成神经管桥，用于修复大鼠的坐骨神经损伤，术后8周和16周获得与自体神经移植同样的效果，16周以后效果弱于自体神经移植。考虑到可能是PHEMA-MMA的机械强度不足以抵抗来自移植物周围长期压力。

　　为了解决这一问题，YusukeKatayama等[22]将PHEMA-MMA管桥管壁设计成波纹样和管壁内放置盘绕物以增强管壁机械强度，并和平直管、自体神经移植做对照。每个管桥管壁均有碱性成纤维细胞生长因子-1和胶原蛋白的混合物。他们用来桥接10mm大鼠坐骨神经缺损，16周后行电生理和组织形态学检查，证明通过盘绕物增强机械强度的PHEMA-MMA管桥具有与自替神经移植相同的神经再生作用。

　　目前PHEMA-MMA由于降解时间难以控制、生理学性质不稳定等问题限制了它的广泛应用。

　　3.化学萃取同种异体神经制备神经管桥

　　异体神经，如果不存在宿主的免疫排斥，理论上是非常理想的移植修复材料。从Gluck（1880）首先尝试到今天已经一个多世纪，人们在持续地探索这种可能性。对移植物进行预处理以去除或减少免疫源性为许多研究者感兴趣。但是各种温度和生理性溶液浸泡变性，不是因为活细胞存在抗原性不除，就是失活移植物在受体内疤痕化而使神经不能再生。

　　Sondell报道应用tritonX一100和脱氧胆酸钠对异体神经进行化学萃取，发现化学萃取能成功地把所有的细胞成分、轴突成分和髓鞘分离并清除，留下了单一的细胞外基质性的基底膜管架结构。他们还在大鼠动物模型上修复神经缺损，神经再生良好，未发现明显免疫排斥和异常炎性反应。

　　tritonX一100和脱氧胆酸钠化学处理方法可以有效清除人类周围神经中的细胞和髓鞘，保留了网管柱状组织结构，保留了SCs基底板层，适合体外培养的自体SCs迁移、成活、扩增，是适合神经移植的修复材料。但是这类材料抗原性去除完全与否、移植物体内塌陷，疤痕化以及能否早期血管化问题依然存在。

　　4.甲壳素类神经管桥

　　甲壳素及其衍生物无毒、无味，具有良好的生物相容性，其分解产物对人体健康无害，在自然界含量极为丰富。由于它有天然的利于细胞黏附和抑制疤痕增生的作用，目前越来越广泛的被应用制备神经管桥。

　　YingYuan等[21]在体外将SCs分别种植甲壳素膜和甲壳素纤维丝上，通过免疫细胞化学染色和MTT法分析细胞活性，证明甲壳素和SCs有良好生物相容性。与甲壳素膜相比，SCs更容易在由甲壳素纤维丝构成的立体支架上成活、迁移。Itoh等用自体神经束、胶原膜管来桥接神经缺损，结果甲壳素组效果较好。他们认为甲壳素具有防止神经细胞死亡和促进神经再生，适合制备神经管桥。

　　PeixunZhang等[23]将体外培养的骨髓基质干细胞（BMSc）和SCs种植到甲壳素管桥内，修复大鼠坐骨神经缺损，并以未种植细胞管桥作为对照，通过电生理学和组织形态学分析证明两组种植细胞管桥效果明显优于未种植细胞组，而且移植的BMSc在体内具有SCs的表型。

　　甲壳素及其衍生物在体内降解速度控制等问题限制了它的广泛应用，目前应加强其与其他生物材料的复合研究，以便取长补短。总而言之，甲壳素膜和甲壳素纤维丝与神经胶原细胞具有良好的亲和性，是良好的周围神经修复材料。如果复合神经生长因子和神经细胞将具有更好效果。

　　三、存在问题和展望

　　神经缺损的桥接仍然是周围神经再生的重要问题之一。应用具有良好生物相容性支架复合生物活性细胞或神经营养因子制备的神经管桥是目前治疗周围神经损伤的最具前景的选择。

　　鉴于神经趋化和神经接触引导是神经再生两大理论，梦想神经管桥能桥接任意长距离缺损是一个错误的方向，它桥接的缺损必然有个极限值。有的学者认为是30mm,目前还没有对这一问题达成共识。但是提高神经再生质量和速度应该是今后研究重点。

　　但是，我们对此必须有一个清醒的认识，因为神经损伤的修复机制十分复杂，研究方法也层出不穷，一个新的治疗方法的发现可能是一个新的问题的开始。